ძირითადი განსხვავება – RT PCR vs QPCR
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია არის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის კონკრეტული რეგიონის გასაძლიერებლად in vitro. 1983 წელს კარი მალისის მიერ ამ ტექნიკის გამოგონების გამო, მეცნიერებს შეუძლიათ კვლევის მიზნებისთვის კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტების ათასობით ან მილიონობით ასლის გაკეთება. ამჟამად იგი გახდა საერთო და რუტინულად შესრულებული ტექნიკა კლინიკურ და კვლევით ლაბორატორიებში მრავალფეროვანი აპლიკაციებისთვის. არსებობს ტრადიციული PCR ტექნიკის ვარიაციები, როგორიცაა RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR და ა.შ. RT PCR და Q PCR არის PCR-ის ორი მნიშვნელოვანი ვარიაცია. RT PCR-სა და Q PCR-ს შორის მთავარი განსხვავებაა ის, რომ RT PCR გამოიყენება გენის ექსპრესიის გამოსავლენად რნმ-დან დამატებითი დნმ-ის (cDNA) ტრანსკრიპტების შექმნის გზით, ხოლო Q PCR გამოიყენება რაოდენობრივად გასაზომად PCR პროდუქტების რეალურ დროში ფლუორესცენტური საღებავების გამოყენებით.
რა არის RT PCR?
შებრუნებული ტრანსკრიფციის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (RT PCR) არის PCR-ის ვარიანტი, რომელიც გამოიყენება რნმ-ის ექსპრესიის გამოსავლენად. ეს არის ძალიან მნიშვნელოვანი მეთოდი ქსოვილებში mRNA ექსპრესიის გამოსავლენად. RT PCR გამოიყენება, როდესაც ნიმუშის საწყისი მასალა არის რნმ. RT PCR-ში შაბლონი mRNA პირველად გარდაიქმნება დამატებით დნმ-ში. ეს ეტაპი კატალიზებულია ფერმენტის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას მიერ და პროცესი ცნობილია როგორც საპირისპირო ტრანსკრიპცია. მეორეც, ტრადიციული PCR გამოიყენება ახლად სინთეზირებული cDNA-სთვის ამპლიფიკაციისთვის.
RT PCR არის უაღრესად მგრძნობიარე ტექნიკა, რომელიც მოითხოვს რნმ-ის ნიმუშის შედარებით მცირე რაოდენობას. RT PCR ჩვეულებრივ გამოიყენება რნმ სახეობების დიაგნოსტიკასა და რაოდენობრივ განსაზღვრაში, განსაკუთრებით რნმ ვირუსების, როგორიცაა ადამიანის იმუნოდეფიციტის ვირუსი და C ჰეპატიტის ვირუსი.
სურათი 01: RT PCR ტექნიკა
რა არის QPCR?
რაოდენობრივი PCR (QPCR) არის PCR-ის ვარიანტი, რომელიც გამოიყენება PCR პროდუქტების რაოდენობრივად გასაზომად. მას ასევე მოიხსენიებენ, როგორც რეალურ დროში პოლიმერაზული ჯაჭვის რეაქციას, რადგან ის ზომავს რეალურ დროში გაძლიერებას რეალურ დროში PCR აპარატის გამოყენებით. ეს არის შესაფერისი მეთოდი ნიმუშში არსებული სამიზნე თანმიმდევრობის ან გენის რაოდენობის დასადგენად. QPCR-ის საინტერესო თვისება ის არის, რომ იგი აერთიანებს როგორც გაძლიერებას, ასევე ნამდვილ რაოდენობრივ განსაზღვრას ერთ საფეხურზე. ამრიგად, გელის ელექტროფორეზის საჭიროება აღმოიფხვრება QPCR ტექნიკით. QPCR იყენებს ფლუორესცენტურ საღებავებს PCR პროდუქტების ეტიკეტირების მიზნით PCR რეაქციების დროს, რაც საბოლოოდ იწვევს პირდაპირ რაოდენობრივ განსაზღვრას. როდესაც PCR პროდუქტები გროვდება, ფლუორესცენტური სიგნალებიც გროვდება და ის გაიზომება რეალური დროის მანქანით. QPCR შეიძლება გაერთიანდეს RT PCR-თან. იგი ცნობილია როგორც RT – QPCR ან QRT – PCR და განიხილება, როგორც ყველაზე ძლიერი, მგრძნობიარე და რაოდენობრივი მეთოდი უჯრედებში ან ქსოვილებში რნმ-ის დონის გამოსავლენად.
SYBR Green და Taqman არის ორი მეთოდი, რომელიც გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ის გაძლიერების პროცესის გამოსავლენად ან დასათვალიერებლად. SYBR Green მეთოდი ხორციელდება ფლუორესცენტური საღებავის გამოყენებით, სახელწოდებით SYBR green და აღმოაჩენს გაძლიერებას საღებავის შეკვრით ორჯაჭვიანი დნმ-ის წარმოქმნით. Taqman ხორციელდება ორმაგი მარკირებული ზონდების გამოყენებით და ამოიცნობს გაძლიერებას ზონდის დეგრადაციის გზით Taq პოლიმერაზას და ფტორფორის გამოყოფის გზით, როგორც ნაჩვენებია სურათზე 02. ორივე მეთოდი აკონტროლებს გაძლიერების პროცესის პროგრესს და აცნობებს პროდუქტის რაოდენობას რეალურ დროში..
რეალურ დროში PCR-ს აქვს მრავალფეროვანი აპლიკაციები, როგორიცაა გენის ექსპრესიის რაოდენობრივი განსაზღვრა, მიკრორნმ და არაკოდირების რნმ ანალიზი, SNP გენოტიპირება, ასლის ნომრის ვარიანტების აღმოჩენა, იშვიათი მუტაციების გამოვლენა, გენმოდიფიცირებული ორგანიზმების აღმოჩენა, ინფექციური აგენტების გამოვლენა. და ა.შ.
სურათი 02: რაოდენობრივი PCR ტექნიკა
რა განსხვავებაა RT PCR-სა და QPCR-ს შორის?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR არის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება გენის ექსპრესიის გამოსავლენად ამპლიფიკაციით. | QPCR არის ტექნიკა, რომელიც აძლიერებს დნმ-ს და ადგენს PCR პროდუქტებს რეალურ დროში. |
| რევერსიული ტრანსკრიპტაზას ფერმენტის ჩართვა | |
| ფერმენტის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა გამოიყენება RT PCR-სთვის. | ფერმენტის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა არ გამოიყენება QPCR-სთვის. |
| ფლუორესცენტურად მარკირებული მოლეკულების გამოყენება | |
| ფლუორესცენტურად მარკირებული საღებავები ან ზონდები არ გამოიყენება RT PCR-სთვის. | ფლუორესცენტურად მარკირებული საღებავები ან ზონდები გამოიყენება QPCR-სთვის. |
| PCR პროდუქტის რაოდენობრივი განსაზღვრა | |
| თუ არ არის დაწყვილებული QPCR-თან, RT PCR არ განსაზღვრავს PCR პროდუქტს. | QPCR რაოდენობრივად გაზომეთ PCR პროდუქტი. |
| საწყისი მასალა | |
| საწყისი მასალაა mRNA. | საწყისი მასალაა დნმ. |
| cDNA სინთეზი | |
| კომპლიმენტური დნმ იწარმოება RT PCR-ის დროს. | კომპლიმენტური დნმ არ წარმოიქმნება QPCR-ის დროს. |
შეჯამება – RT PCR vs QPCR
RT PCR და QPCR არის ტრადიციული PCR-ის ორი ვერსია. RT PCR ტექნიკა შესრულებულია mRNA ნიმუშებისთვის და ის განპირობებულია საპირისპირო ტრანსკრიფციით და cDNA-ს წარმოებით. QPCR გამოიყენება PCR პროდუქტების რაოდენობრივი დასადგენად რეალურ დროში PCR თერმული ციკლების დროს ფლუორესცენტური საღებავების ან ეტიკეტირებული ზონდების გამოყენებით. QPCR-ში, PCR პროდუქტის რაოდენობა წარმოდგენილია ნიმუშის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენტური სიგნალებით. RT PCR ფართოდ გამოიყენება, როგორც გამაძლიერებელი პროცესი, ხოლო QPCR ჩვეულებრივ გამოიყენება როგორც რაოდენობრივი პროცესი. ეს არის განსხვავება RT PCR-სა და QPCR-ს შორის.
