ძირითადი განსხვავება - გენის კლონირება PCR-ის წინააღმდეგ
დნმ-ის მრავალი ასლის სინთეზს კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტიდან ეწოდება დნმ-ის გაძლიერება. არსებობს დნმ-ის გაძლიერების ორი ძირითადი პროცესი, კერძოდ გენის კლონირება და PCR. მთავარი განსხვავება გენის კლონირებასა და PCR-ს შორის არის ის, რომ გენის კლონირება აწარმოებს კონკრეტული გენის მრავალ ასლს in vivo რეკომბინანტული დნმ-ის აგებით და მასპინძელი ბაქტერიის შიგნით ზრდით, ხოლო PCR აწარმოებს კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტის მილიონ ასლს in vitro განმეორებით ციკლებში. დენატურაცია და სინთეზი.
რა არის გენის კლონირება?
გენის კლონირება არის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება ორგანიზმის ამოღებული გენომიური დნმ-დან კონკრეტული გენის განთავსებისა და გასამრავლებლად რეკომბინანტული დნმ-ის აგების გზით.გენომიური დნმ შეიცავს ათასობით სხვადასხვა გენს, რომლებიც დაშიფრულია ცილებისთვის. როდესაც დნმ ამოღებულია, ის მოიცავს ყველა შესაძლო გენს, რომელიც მას შეუძლია. გენის კლონირების ტექნიკამ შესაძლებელი გახადა კონკრეტული გენის გამოვლენა მთლიანი დნმ-დან. ამიტომ გენის კლონირება მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტია მოლეკულურ ბიოლოგიაში.
ორგანიზმის გენომიური ბიბლიოთეკის შექმნა აუცილებელია გენის კლონირებისთვის, თუ არ არსებობს ინფორმაცია დნმ-ში შესაბამისი გენის ადგილმდებარეობის შესახებ. გენომიური ბიბლიოთეკა მზადდება შემდეგი ნაბიჯების გამოყენებით.
ნაბიჯი 1: მთლიანი დნმ-ის ამოღება ორგანიზმიდან, რომელიც შეიცავს სასურველ გენს.
ნაბიჯი 2: ამოღებული დნმ-ის მონელების შეზღუდვა მცირე მართვადი ფრაგმენტების წარმოებისთვის. ამ ნაბიჯს ხელს უწყობს შეზღუდვის ენდონუკლეაზები.
ნაბიჯი 3: შესაფერისი ვექტორის შერჩევა და ვექტორის დნმ-ის გახსნა იგივე შეზღუდვის ენდონუკლეაზების გამოყენებით. ბაქტერიული პლაზმიდები ჩვეულებრივ გამოიყენება როგორც ვექტორები უცხო დნმ-ის გადასატანად. პლაზმიდები არის დნმ-ის მცირე წრეები, რომლებიც მდებარეობს ბაქტერიებში.
ნაბიჯი 4: ვექტორული დნმ-ის და ფრაგმენტირებული დნმ-ის გაერთიანება რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულის წარმოქმნით. ამ საფეხურს მართავს დნმ ლიგაზა.
ნაბიჯი 5: რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულების გადატანა მასპინძელ ბაქტერიებში. ეს ნაბიჯი ცნობილია როგორც ტრანსფორმაცია და კეთდება სითბური შოკის გამოყენებით.
ნაბიჯი 5: ტრანსფორმირებული ბაქტერიული უჯრედების სკრინინგი კულტურის გარემოზე. ტრანსფორმაციის პროცესის ბოლოს მიიღება ტრანსფორმირებული და არატრანსფორმირებული მასპინძელი უჯრედების შერეული პოპულაცია. როგორც ინტერესის გენი მოიცავს მხოლოდ ტრანსფორმირებულ მასპინძელ უჯრედებს. აქედან გამომდინარე, აუცილებელია ტრანსფორმირებული უჯრედების შერჩევა. შერჩევა ხდება სელექციური საშუალებების გამოყენებით, რომლებიც შეიცავს ანტიბიოტიკებს. მხოლოდ ტრანსფორმირებული უჯრედები იზრდება ამ სკრინინგის გარემოზე, რაც არჩევის საშუალებას იძლევა.
ნაბიჯი 6: ბაქტერიების ზრდა გენების ბიბლიოთეკის შესაქმნელად. ამ საფეხურზე ტრანსფორმირებული მასპინძელი უჯრედები შეჰყავთ ახალ კულტურაში, რაც უზრუნველყოფს ზრდის ოპტიმალურ მოთხოვნებს. მთლიანი კოლონიები კულტურის ფირფიტებზე წარმოადგენს ამ ორგანიზმის გენომიურ ბიბლიოთეკას.
ნაბიჯი 7: რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულა, რომელიც შეიცავს საინტერესო გენს, უნდა შემოწმდეს რეკომბინანტული დნმ-ის ათასობით კლონირებული ფრაგმენტიდან. ეს შეიძლება განხორციელდეს ზონდების გამოყენებით, რომლებიც აღნიშნავენ კონკრეტულ გენს ან ამ გენის სპეციფიკურ პროტეინს.
როდესაც ბაქტერიული კოლონიის შემცველი დაინტერესებული გენი გამოვლინდება მთლიანი კოლონიებიდან, შესაძლებელი იქნება რეკომბინანტული პლაზმიდის მილიონობით ასლის შექმნა, რომელიც შეიცავს გენს.
გენის კლონირება გამოიყენება გენების ბიბლიოთეკების შესაქმნელად, სპეციალური ცილების, ვიტამინების, ანტიბიოტიკების, ჰორმონების წარმოებისთვის, ორგანიზმების გენომის თანმიმდევრობის დადგენისა და რუკების შესაქმნელად, კრიმინალისტიკაში ინდივიდების დნმ-ის მრავალჯერადი ასლების შესაქმნელად და ა.შ.
სურათი_1: გენის კლონირება
რა არის PCR?
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) არის ტექნიკა, რომელიც წარმოქმნის კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტის ასლების დიდ რაოდენობას. კონკრეტული დნმ-ის თანმიმდევრობის ექსპონენციალური გაძლიერება მიიღება PCR-ით ინ ვიტრო პირობებში. ეს ტექნიკა ძალიან მძლავრი ინსტრუმენტია მოლეკულურ ბიოლოგიაში, რადგან მას შეუძლია დნმ-ის მცირე ნიმუშის გამოსაყენებლად გამრავლება. PCR დაინერგა კარი მალისმა 1983 წელს და ამ პრიზიორმა გამოგონებამ შექმნა უზარმაზარი წინსვლა მოლეკულურ ბიოლოგიაში.
PCR ტექნიკა მიჰყვება განმეორებით PCR რეაქციებს, როგორც ნაჩვენებია ნახატ 02-ში. ერთი PCR რეაქცია შედგება სამი ძირითადი საფეხურისაგან, რომელიც მიმდინარეობს სამ სხვადასხვა ტემპერატურაზე; ორჯაჭვიანი დნმ-ზე დენატურაცია 94 0C-ზე, პრაიმერების ანეილირება 68 0C-ზე და ჯაჭვის დრეკადობა 72 0-ზე C. ამიტომ, როდესაც PCR კეთდება, ტემპერატურის მერყეობა უნდა შენარჩუნდეს სათანადო რეპლიკაციისთვის. PCR ხორციელდება PCR აპარატში PCR მილების შიგნით. PCR მილები დატვირთულია სწორი PCR ნარევებით, რომლებიც შეიცავს შაბლონის დნმ-ს, Taq პოლიმერაზას, პრაიმერებს, dNTP-ებს და ბუფერს.ორჯაჭვიანი ნიმუშის დნმ-ის დენატურაცია ერთჯაჭვიან დნმ-ად ხდება წყალბადის ბმების გაწყვეტით დამატებით ფუძეებს შორის 94 – 98 0C. შემდეგ შაბლონის დნმ-ის ცალკეული ჯაჭვები გამოფენილია პრაიმერებისთვის. უზრუნველყოფილი უნდა იყოს წყვილი პრაიმერი (წინ და უკან) და ისინი უნდა იყოს თერმოსტაბილური მაღალი ტემპერატურის შესანარჩუნებლად. პრაიმერები არის ერთჯაჭვიანი მოკლე დნმ-ის თანმიმდევრობები, რომლებიც ავსებენ სამიზნე დნმ-ის ფრაგმენტის ბოლოებს. PCR-ში გამოიყენება სინთეზური პრაიმერები. პრაიმერები უკავშირდება ნიმუშის დნმ-ის დამატებით ფუძეებს და იწყებენ ახალი ჯაჭვის სინთეზს. ეს ეტაპი კატალიზებულია ფერმენტის მიერ, რომელსაც ეწოდება Taq პოლიმერაზა; თერმოსტაბილური დნმ პოლიმერაზას ფერმენტი, გამოყოფილი Thermus auqaticus-ისგან. როდესაც პრაიმერები და ნუკლეოტიდები (სამშენებლო ბლოკები) ხელმისაწვდომია, Taq პოლიმერაზა აყალიბებს დნმ-ის ახალ ჯაჭვს, რომელიც ავსებს შაბლონის დნმ-ს. PCR პროგრამის დასასრულს შეინიშნება გაძლიერებული დნმ-ის ფრაგმენტი გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით. თუ საჭიროა დამატებითი ანალიზი, PCR პროდუქტი იწმინდება გელისგან.
PCR ძალიან სასარგებლოა გენეტიკური და შეძენილი დაავადებების დიაგნოსტიკისა და მონიტორინგისთვის, კრიმინალების იდენტიფიკაციისთვის (კრიმინალისტიკის სფეროში), დნმ-ის მიზნობრივი სეგმენტის სტრუქტურისა და ფუნქციის შესასწავლად, ორგანიზმების გენომის თანმიმდევრობის დასადგენად და რუკების შესასწავლად, PCR გახდა რუტინული ლაბორატორიული ტექნიკა მეცნიერთა შორის სამედიცინო და მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევის ლაბორატორიებში, რადგან მას აქვს მრავალფეროვანი აპლიკაციები.
სურათი_2: პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია
რა განსხვავებაა გენის კლონირებასა და PCR-ს შორის?
გენის კლონირება vs PCR |
|
| გენის კლონირება არის კონკრეტული გენის მრავალჯერადი ასლების დამზადების პროცესი in vivo რეკომბინანტული დნმ-ის მეშვეობით და გარდაიქმნება მასპინძელ ბაქტერიად. | PCR ტექნიკა აწარმოებს კონკრეტული დნმ-ის მიმდევრობის მრავალ ასლს in vitro PCR რეაქციების განმეორებითი ციკლების მეშვეობით. |
| რეკომბინანტული დნმ-ის აგების მოთხოვნა | |
| რეკომბინანტული დნმ იწარმოება გენის ადგილმდებარეობის დასადგენად. | რეკომბინანტული დნმ არ წარმოიქმნება. |
| შრომის საჭიროება | |
| ეს პროცესი შრომატევადი. | ინტენსიური შრომა არ არის საჭირო. |
| In vivo ან In vitro პროცესი | |
| რეკომბინანტული დნმ-ის აგება არის in vitro და დნმ-ის გაძლიერება არის in vivo. | დნმ-ის გაძლიერება ხდება მთლიანად in vitro. |
შეჯამება - გენის კლონირება PCR-ის წინააღმდეგ
გენის კლონირება და PCR არის ორი მეთოდი, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის ამპლიფიკაციისთვის. PCR არის ინ ვიტრო პროცესი, რომელიც ქმნის კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტის დნმ-ის მრავალ ასლს რეკომბინანტული დნმ-ისა და მასპინძელი ორგანიზმის გამოყენების გარეშე. გენის კლონირება, უპირველეს ყოვლისა, არის in vivo პროცესი, რომელიც იწვევს დაინტერესებული გენის მრავალ ასლს მასპინძელ ორგანიზმში რეკომბინანტული დნმ-ის აგების გზით. ეს არის განსხვავება გენის კლონირებასა და PCR-ს შორის.
