ძირითადი განსხვავება – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
დნმ-ის თანმიმდევრობა ძალიან მნიშვნელოვანია დნმ-ის ანალიზისთვის, ვინაიდან დნმ-ის კონკრეტულ რეგიონზე ნუკლეოტიდების სწორი განლაგების ცოდნა ავლენს მის შესახებ ბევრ მნიშვნელოვან ინფორმაციას. არსებობს დნმ-ის თანმიმდევრობის სხვადასხვა მეთოდი. Sanger sequencing და Pyrosequencing არის ორი განსხვავებული დნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი, რომელიც ფართოდ გამოიყენება მოლეკულურ ბიოლოგიაში. Sanger-ის თანმიმდევრობასა და პიროსეკვენციას შორის მთავარი განსხვავებაა ის, რომ Sanger-ის თანმიმდევრობა იყენებს დიდოქსინუკლეოტიდებს დნმ-ის სინთეზის შესაწყვეტად ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის წასაკითხად, ხოლო პიროფოსფატის გამოყოფა აღმოაჩენს ნუკლეოტიდებს და თანმიმდევრობის ზუსტი თანმიმდევრობის სინთეზს.
რა არის Sanger Sequencing?
სანჯერის თანმიმდევრობა არის პირველი თაობის დნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი, რომელიც შეიმუშავეს ფრედერიკ სენგერმა და მისმა კოლეჯებმა 1977 წელს. იგი ასევე ცნობილია როგორც ჯაჭვის შეწყვეტის თანმიმდევრობა ან დიდეოქსის თანმიმდევრობა, რადგან ის დაფუძნებულია დიდოქსინუკლეოტიდებით (ddNTPs) მიერ ჯაჭვის შეწყვეტაზე. ეს მეთოდი ფართოდ გამოიყენებოდა 30 წელზე მეტი ხნის განმავლობაში, სანამ არ შეიქმნა ახალი თაობის თანმიმდევრობა (NGS). სანჯერის თანმიმდევრობის მეთოდით შესაძლებელი გახდა სწორი ნუკლეოტიდური რიგის აღმოჩენა ან დნმ-ის კონკრეტული ფრაგმენტის მიმაგრება. იგი ემყარება ddNTP-ების შერჩევით ჩართვას და დნმ-ის სინთეზის შეწყვეტას ინ ვიტრო დნმ-ის რეპლიკაციის დროს. 3' OH ჯგუფების არარსებობა მეზობელ ნუკლეოტიდებს შორის ფოსფოდიესტერული ბმის წარმოქმნის გასაგრძელებლად არის ddNTP-ების უნიკალური თვისება. მაშასადამე, როგორც კი ddNTP მიმაგრებულია, ჯაჭვის გახანგრძლივება წყდება და მთავრდება ამ წერტილიდან. არსებობს ოთხი ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP და ddTTP - გამოიყენება Sanger-ის თანმიმდევრობით. ეს ნუკლეოტიდები აჩერებენ დნმ-ის რეპლიკაციის პროცესს, როდესაც ისინი შედიან დნმ-ის მზარდ ჯაჭვში და იწვევს მოკლე დნმ-ის სხვადასხვა სიგრძეს.კაპილარული გელის ელექტროფორეზი გამოიყენება დნმ-ის ამ მოკლე ჯაჭვების ორგანიზებისთვის მათი ზომების მიხედვით გელზე, როგორც ნაჩვენებია სურათზე 01.
სურათი 1: სინთეზირებული მოკლე დნმ-ის კაპილარული გელის ელექტროფორეზი
დნმ-ის ინ ვიტრო რეპლიკაციისთვის, რამდენიმე მოთხოვნა უნდა იყოს უზრუნველყოფილი. ეს არის დნმ-პოლიმერაზას ფერმენტი, შაბლონური დნმ, ოლიგონუკლეოტიდური პრაიმერები და დეოქსინუკლეოტიდები (dNTPs). Sanger-ის თანმიმდევრობით, დნმ-ის რეპლიკაცია ხორციელდება ოთხ ცალკეულ საცდელ მილში, ცალ-ცალკე ოთხი ტიპის ddNTP-თან ერთად. დეოქსინუკლეოტიდები მთლიანად არ იცვლება შესაბამისი ddNTP-ებით. კონკრეტული dNTP-ის ნარევი (მაგალითად, dATP + ddATP) შედის მილში და მრავლდება. ოთხი ცალკე მილის პროდუქტი იწარმოება გელზე ოთხ ცალკეულ ჭაბურღილში. შემდეგ გელის წაკითხვით, თანმიმდევრობა შეიძლება აშენდეს, როგორც ნაჩვენებია ნახატ 02-ში.
სურათი 02: სენგერის თანმიმდევრობა
სანჯერის თანმიმდევრობა არის მნიშვნელოვანი ტექნიკა, რომელიც ეხმარება მოლეკულური ბიოლოგიის ბევრ სფეროში. ადამიანის გენომის პროექტი წარმატებით დასრულდა Sanger-ის თანმიმდევრობაზე დაფუძნებული მეთოდების დახმარებით. სანჯერის თანმიმდევრობა ასევე სასარგებლოა სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობის, კიბოს და გენეტიკური დაავადებების კვლევაში, გენის ექსპრესიის ანალიზში, ადამიანის იდენტიფიკაციაში, პათოგენის გამოვლენაში, მიკრობული თანმიმდევრობის და ა.შ.
სანჯერის თანმიმდევრობის რამდენიმე უარყოფითი მხარეა:
- დნმ-ის სიგრძე, რომლის თანმიმდევრობა არ შეიძლება იყოს 1000 ბაზის წყვილზე მეტი
- მხოლოდ ერთი სტრიქონის თანმიმდევრობა შესაძლებელია ერთდროულად.
- პროცესი შრომატევადი და ძვირია.
ამიტომ, ამ პრობლემების დასაძლევად დროთა განმავლობაში შემუშავდა ახალი მოწინავე თანმიმდევრობის ტექნიკა. თუმცა, Sanger-ის თანმიმდევრობა ჯერ კიდევ გამოიყენება მისი უაღრესად ზუსტი შედეგების გამო დაახლოებით 850 ბაზის წყვილის სიგრძის ფრაგმენტამდე.
რა არის პიროთანმიმდევრობა?
პიროსეკვენსირება არის დნმ-ის თანმიმდევრობის ახალი ტექნიკა, რომელიც დაფუძნებულია "თანმიმდევრობა სინთეზით". ეს ტექნიკა ეყრდნობა პიროფოსფატის გამოყოფის გამოვლენას ნუკლეოტიდის ინკორპორაციაზე. პროცესს იყენებს ოთხი განსხვავებული ფერმენტი: დნმ პოლიმერზა, ატფ სულფურილაზა, ლუციფერაზა და აპირაზა და ორი სუბსტრატი ადენოზინ 5'ფოსფოსულფატი (APS) და ლუციფერინი.
პროცესი იწყება პრაიმერის მიერთებით ერთჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონთან და დნმ პოლიმერაზა იწყებს მას დამატებითი ნუკლეოტიდების ინკორპორაციას. როდესაც ნუკლეოტიდები ერთმანეთს უერთდებიან (ნუკლეინის მჟავას პოლიმერიზაცია), ის ათავისუფლებს პიროფოსფატულ (ორი ფოსფატის ჯგუფი ერთმანეთთან შეკრული) ჯგუფებს და ენერგიას.თითოეული ნუკლეოტიდის დამატება გამოყოფს პიროფოსფატის თანაბარ რაოდენობას. პიროფოსფატი გარდაიქმნება ATP-ად ATP სულფურილაზას მიერ სუბსტრატის APS-ის თანდასწრებით. გენერირებული ATP ახორციელებს ლუციფერაზას შუამავლობით ლუციფერინის ოქსილუციფერინად გარდაქმნას, რაც აწარმოებს ხილულ შუქს ატფ-ების რაოდენობის პროპორციული რაოდენობით. სინათლე გამოვლენილია ფოტონების აღმოჩენის მოწყობილობით ან ფოტოგამრავლებით და ქმნის პიროგრამას. აპირაზა ანადგურებს ATP და არაინკორპორირებულ dNTP-ებს რეაქციულ ნარევში. dNTP დამატება კეთდება ერთხელ. ვინაიდან ნუკლეოტიდის დამატება ცნობილია სინათლის ჩართვისა და გამოვლენის მიხედვით, შაბლონის თანმიმდევრობა შეიძლება განისაზღვროს. პიროგრამა გამოიყენება ნიმუშის დნმ-ის ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის გენერირებისთვის, როგორც ნაჩვენებია სურათზე 03.
პიროსეკვენსირება ძალზე მნიშვნელოვანია ერთნუკლეოტიდის პოლიმორფიზმის ანალიზსა და დნმ-ის მოკლე მონაკვეთების თანმიმდევრობის განსაზღვრაში. მაღალი სიზუსტე, მოქნილობა, ავტომატიზაციის სიმარტივე და პარალელური დამუშავება არის პიროსეკვენირების უპირატესობა Sanger-ის თანმიმდევრობის ტექნიკასთან შედარებით.
სურათი 03: პიროსთანმიმდევრობა
რა განსხვავებაა Sanger Sequencing-სა და Pyrosequencing-ს შორის?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| სანჯერის თანმიმდევრობა არის დნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია ddNTP-ების შერჩევით ინკორპორაციაზე დნმ პოლიმერაზასა და ჯაჭვის შეწყვეტით. | პიროსეკვენსირება არის დნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია პიროფოსფატის გამოყოფის გამოვლენაზე ნუკლეოტიდის ინკორპორაციისას. |
| ddNTP-ის გამოყენება | |
| ddNTP გამოიყენება დნმ-ის რეპლიკაციის შესასრულებლად | ddNTP არ გამოიყენება. |
| ფერმენტები ჩართული | |
| გამოიყენება დნმ პოლიმერაზა. | გამოიყენება ოთხი ფერმენტი: დნმ პოლიმერაზა, ატფ სულფურილაზა, ლუციფერაზა და აპირაზა. |
| გამოყენებული სუბსტრატები | |
| APS და ლუციფერინი არ გამოიყენება. | გამოიყენება ადენოზინ 5' ფოსფოსულფატი (APS) და ლუციფერინი. |
| მაქსიმალური ტემპერატურა | |
| ეს ნელი პროცესია. | ეს სწრაფი პროცესია. |
რეზიუმე – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger თანმიმდევრობა და პიროსეკვენსირება არის დნმ-ის თანმიმდევრობის ორი მეთოდი, რომელიც გამოიყენება მოლეკულურ ბიოლოგიაში. სანჯერის თანმიმდევრობა აყალიბებს ნუკლეოტიდების რიგს თანმიმდევრობით ჯაჭვის გახანგრძლივების შეწყვეტით, ხოლო პიროსეკვენირება აყალიბებს ნუკლეოტიდების ზუსტ წესრიგს თანმიმდევრობით ნუკლეოტიდების ჩართვისა და პიროფოსფატების გამოყოფის გამოვლენით.მაშასადამე, მთავარი განსხვავება Sanger-ის თანმიმდევრობასა და პიროსეკვენციას შორის არის ის, რომ Sanger-ის თანმიმდევრობა მუშაობს ჯაჭვის შეწყვეტით თანმიმდევრობაზე, ხოლო პიროსეკვენირება მუშაობს სინთეზით..
