ძირითადი სხვაობა – მიკრომასია რნმ-ის თანმიმდევრობის წინააღმდეგ
ტრანსკრიპტომი წარმოადგენს უჯრედში არსებული რნმ-ის მთლიან შემცველობას, მათ შორის mRNA, rRNA, tRNA, დეგრადირებული რნმ და არადეგრადირებული რნმ. ტრანსკრიპტომის პროფილირება მნიშვნელოვანი პროცესია უჯრედის შეხედულებების გასაგებად. არსებობს რამდენიმე მოწინავე მეთოდი ტრანსკრიპტომის პროფილირებისთვის. მიკროსარეი და რნმ-ის თანმიმდევრობა არის ორი ტიპის ტექნოლოგია, რომელიც შემუშავებულია ტრანსკრიპტომის გასაანალიზებლად. მიკრომასივისა და რნმ-ის თანმიმდევრობას შორის მთავარი განსხვავებაა ის, რომ მიკრომასივობა ემყარება წინასწარ შემუშავებული ეტიკეტირებული ზონდების ჰიბრიდიზაციის პოტენციალს სამიზნე cDNA თანმიმდევრობებთან, ხოლო რნმ-ის თანმიმდევრობა ემყარება cDNA ძაფების პირდაპირ თანმიმდევრობას დაფუძნებული თანმიმდევრობის მოწინავე ტექნიკით, როგორიცაა NGS.მიკრომასია შესრულებულია თანმიმდევრობების შესახებ წინასწარი ცოდნით, ხოლო რნმ-ის თანმიმდევრობა ხორციელდება თანმიმდევრობების შესახებ წინასწარი ცოდნის გარეშე.
რა არის Microarray?
Microarray არის ძლიერი, საიმედო და მაღალი გამტარუნარიანობის მეთოდი, რომელიც გამოიყენება მეცნიერების მიერ ტრანსკრიპტომის პროფილირებისთვის. ეს არის ყველაზე პოპულარული მიდგომა ტრანსკრიპტის ანალიზისთვის. ეს არის იაფი მეთოდი, რომელიც დამოკიდებულია ჰიბრიდიზაციის ზონდებზე.
ტექნიკა იწყება mRNA-ის ამოღებით ნიმუშიდან და cDNA ბიბლიოთეკის აგებით მთლიანი რნმ-დან. შემდეგ მას ურევენ ფლუორესცენტურად მონიშნულ წინასწარ შემუშავებულ ზონდებს მყარ ზედაპირზე (ლაქების მატრიცა). დამატებითი თანმიმდევრობები ჰიბრიდირებულია ეტიკეტირებულ ზონდებთან მიკრო მასივში. შემდეგ მიკრო მასივი ირეცხება და სკრინინგდება და გამოსახულება რაოდენობრივად განისაზღვრება. შეგროვებული მონაცემები უნდა გაანალიზდეს შედარებითი გამოხატვის პროფილების მისაღებად.
მიკროსივების ზონდების ინტენსივობა მიჩნეულია ნიმუშში არსებული ტრანსკრიპტების რაოდენობის პროპორციულად.თუმცა, ტექნიკის სიზუსტე დამოკიდებულია დაპროექტებულ ზონდებზე, თანმიმდევრობის წინასწარ ცოდნაზე და ზონდების ჰიბრიდიზაციის აფინურობაზე. აქედან გამომდინარე, მიკროსარეის ტექნოლოგიას აქვს შეზღუდვები. Microarray ტექნიკა არ შეიძლება შესრულდეს დაბალი სიმრავლის ტრანსკრიპტებით. ის ვერ ახერხებს იზოფორმების დიფერენცირებას და გენეტიკური ვარიანტების იდენტიფიცირებას. ვინაიდან ეს მეთოდი დამოკიდებულია ზონდების ჰიბრიდიზაციაზე, ჰიბრიდიზაციასთან დაკავშირებული ზოგიერთი პრობლემა, როგორიცაა ჯვარედინი ჰიბრიდიზაცია, არასპეციფიკური ჰიბრიდიზაცია და ა.შ. წარმოიქმნება მიკროსარეის ტექნიკაში.
სურათი 01: მიკრომასივი
რა არის რნმ-ის თანმიმდევრობა?
RNA თოფის თანმიმდევრობა (RNA seq) არის ახლახან შემუშავებული მთლიანი ტრანსკრიპტომის თანმიმდევრობის ტექნიკა. ეს არის ტრანსკრიპტომის პროფილირების სწრაფი და მაღალი გამტარუნარიანობის მეთოდი. ის პირდაპირ აფასებს გენების ექსპრესიას და იწვევს ტრანსკრიპტომის ღრმა გამოკვლევას.რნმ-ის თანმიმდევრობა არ არის დამოკიდებული წინასწარ შემუშავებულ ზონდებზე ან თანმიმდევრობის წინასწარ ცოდნაზე. აქედან გამომდინარე, რნმ seq მეთოდს აქვს მაღალი მგრძნობელობა და ახალი გენების და გენეტიკური ვარიანტების გამოვლენის შესაძლებლობა.
რნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი შესრულებულია რამდენიმე საფეხურით. უჯრედის მთლიანი რნმ უნდა იყოს იზოლირებული და ფრაგმენტირებული. შემდეგ, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას გამოყენებით, უნდა მომზადდეს cDNA ბიბლიოთეკა. თითოეული cDNA ჯაჭვი უნდა იყოს ლიგირებული ადაპტორებით. შემდეგ ლიგირებული ფრაგმენტები უნდა გაძლიერდეს და გაიწმინდოს. საბოლოოდ, NGS მეთოდის გამოყენებით, უნდა განხორციელდეს cDNA-ს თანმიმდევრობა.
სურათი 02: რნმ-ის თანმიმდევრობა
რა განსხვავებაა მიკრომასივებსა და რნმ-ის თანმიმდევრობას შორის?
მიკრომასივი რნმ-ის თანმიმდევრობის წინააღმდეგ |
|
| მიკრომასივი არის ძლიერი, საიმედო, მაღალი გამტარუნარიანობის მეთოდი. | რნმ-ის თანმიმდევრობა არის ზუსტი და მაღალი გამტარუნარიანობის მეთოდი. |
| ფასი | |
| ეს არის იაფი მეთოდი. | ეს ძვირადღირებული მეთოდია. |
| ნიმუშების დიდი რაოდენობის ანალიზი | |
| ეს აადვილებს ნიმუშების დიდი რაოდენობის ანალიზს ერთდროულად. | ეს აადვილებს ნიმუშების დიდი რაოდენობის ანალიზს. |
| მონაცემთა ანალიზი | |
| მონაცემთა ანალიზი რთულია. | ამ მეთოდით მეტი მონაცემები გენერირებულია; შესაბამისად, პროცესი უფრო რთულია. |
| მიმდევრობის წინასწარი ცოდნა | |
| ეს მეთოდი ეფუძნება ჰიბრიდიზაციის ზონდებს, ამიტომ აუცილებელია თანმიმდევრობების წინასწარი ცოდნა. | ეს მეთოდი არ არის დამოკიდებული წინა თანმიმდევრობის ცოდნაზე. |
| სტრუქტურული ვარიაციები და ახალი გენები | |
| ამ მეთოდს არ შეუძლია აღმოაჩინოს სტრუქტურული ვარიაციები და ახალი გენები. | ამ მეთოდს შეუძლია აღმოაჩინოს სტრუქტურული ვარიაციები, როგორიცაა გენების შერწყმა, ალტერნატიული შერწყმა და ახალი გენები. |
| მგრძნობელობა | |
| ეს ვერ აღმოაჩენს იზოფორმების გამოხატვის განსხვავებებს, ამიტომ მას აქვს შეზღუდული მგრძნობელობა. | ამას აქვს მაღალი მგრძნობელობა. |
| შედეგი | |
| ამამ შეიძლება გამოიწვიოს მხოლოდ გამოხატვის ფარდობითი დონეები. ეს არ იძლევა გენის ექსპრესიის აბსოლუტურ რაოდენობებს. | ის იძლევა გამოხატვის აბსოლუტურ და ფარდობით დონეებს. |
| მონაცემთა ხელახალი ანალიზი | |
| ეს ხელახლა უნდა განმეორდეს ხელახლა ანალიზისთვის. | თანმიმიმდევრობის მონაცემების ხელახლა ანალიზი შეიძლება. |
| საჭიროება კონკრეტული პერსონალი და ინფრასტრუქტურა | |
| სპეციფიკური ინფრასტრუქტურა და პერსონალი არ არის საჭირო მიკრომასივისთვის. | სპეციფიკური ინფრასტრუქტურა და პერსონალი საჭირო რნმ-ის თანმიმდევრობით. |
| ტექნიკური საკითხები | |
| მიკროსივების ტექნიკას აქვს ტექნიკური საკითხები, როგორიცაა ჯვარედინი ჰიბრიდიზაცია, არასპეციფიკური ჰიბრიდიზაცია, ცალკეული ზონდების გამოვლენის შეზღუდული სიჩქარე და ა.შ. | RNA seq ტექნიკა თავიდან აიცილებს ტექნიკურ საკითხებს, როგორიცაა ჯვარედინი ჰიბრიდიზაცია, არასპეციფიკური ჰიბრიდიზაცია, ცალკეული ზონდების გამოვლენის შეზღუდული სიჩქარე და ა.შ. |
| მიკერძოება | |
| ეს არის მიკერძოებული მეთოდი, რადგან ის დამოკიდებულია ჰიბრიდიზაციაზე. | მიკერძოება დაბალია მიკრომასივთან შედარებით. |
შეჯამება – მიკრომასივება რნმ-ის თანმიმდევრობის წინააღმდეგ
მიკროსივების და რნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდები არის მაღალი გამტარუნარიანობის პლატფორმები, რომლებიც შემუშავებულია ტრანსკრიპტომის პროფილირებისთვის. ორივე მეთოდი იძლევა შედეგებს, რომლებიც დიდ კორელაციაშია გენის ექსპრესიის პროფილებთან. თუმცა, რნმ-ის თანმიმდევრობას აქვს უპირატესობები გენის ექსპრესიის ანალიზისთვის მიკროსარეისთან შედარებით. რნმ-ის თანმიმდევრობა უფრო მგრძნობიარე მეთოდია დაბალი სიმრავლის ტრანსკრიპტების გამოსავლენად, ვიდრე მიკრომასია. რნმ-ის თანმიმდევრობა ასევე იძლევა იზოფორმების დიფერენცირებას და გენის ვარიანტების იდენტიფიკაციას. თუმცა, მიკრომასია მკვლევართა უმეტესობის საერთო არჩევანია, რადგან რნმ-ის თანმიმდევრობა არის ახალი და ძვირადღირებული ტექნიკა მონაცემთა შენახვის გამოწვევებითა და მონაცემთა რთული ანალიზით.
