ძირითადი განსხვავება – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green და Taqman არის ორი მეთოდი, რომელიც გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ის გაძლიერების პროცესის გამოსავლენად ან დასათვალიერებლად. SYBR Green არის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია ნუკლეინის მჟავას შეღებვის საღებავზე, ხოლო Taqman არის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია ჰიდროლიზის ზონდზე. ორივე ტექნოლოგია შექმნილია PCR-ის დროს ფლუორესცენციის შესაქმნელად, რაც საშუალებას აძლევს რეალურ დროში PCR აპარატს აკონტროლოს რეაქცია „რეალურ დროში“. SYBR Green მეთოდი ხორციელდება ფლუორესცენტური საღებავის გამოყენებით, სახელწოდებით SYBR green და აღმოაჩენს გაძლიერებას საღებავის მიერ წარმოქმნილ ორჯაჭვიან დნმ-თან. Taqman ხორციელდება ორმაგი მარკირებული ზონდების გამოყენებით და ამოიცნობს გაძლიერებას ზონდის დეგრადაციის გზით Taq პოლიმერაზას და ფტორფორის გამოყოფით.ეს არის მთავარი განსხვავება SYBR Green-სა და Taqman-ს შორის.
რა არის SYBR Green?
SYBR მწვანე არის ფლუორესცენტური საღებავი, რომელიც გამოიყენება ნუკლეინის მჟავების, განსაკუთრებით ორჯაჭვიანი დნმ-ის შესაღებად მოლეკულურ ბიოლოგიაში. SYBR Green მეთოდი გამოიყენება PCR პროდუქტების რაოდენობრივი დასადგენად რეალურ დროში PCR-ის დროს. დნმ-თან შეერთების შემდეგ, დნმ-ს საღებავის კომპლექსი შთანთქავს ლურჯ შუქს და ასხივებს ინტენსიურ მწვანე შუქს. ეს ხდება სტრუქტურული ცვლილების გამო, რომელიც ხდება საღებავის მოლეკულაში ორჯაჭვიან დნმ-თან შეერთებისას. როდესაც PCR ქმნის უფრო და უფრო მეტ დნმ-ს, უფრო მეტი საღებავის მოლეკულა უკავშირდება დნმ-ს და წარმოქმნის მეტ ფლუორესცენციას. ამიტომ, ფლუორესცენცია იზრდება PCR პროდუქტის დაგროვებით. ამრიგად, PCR პროდუქტის რაოდენობა შეიძლება რაოდენობრივად გაიზომოს SYBR Green ფლუორესცენციის გამოვლენით.
SYBR მწვანე საღებავი ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას დნმ-ის მარკირებისთვის ციტომეტრიაში და ფლუორესცენტულ მიკროსკოპში. ეთიდიუმის ბრომიდი წარმატებით შეიცვალა SYBR Green-ით, ვინაიდან ეთიდიუმის ბრომიდი არის კანცეროგენული საღებავი, გელი ელექტროფორეზის დროს დნმ-ის ვიზუალიზაციის დროს განადგურების პრობლემებით.
SYBR მწვანე მეთოდს აქვს დადებითი და უარყოფითი მხარეები. ეს მეთოდი ძალიან მგრძნობიარე, იაფი და მარტივი გამოსაყენებელია. თუმცა, ნებისმიერი ორჯაჭვიანი დნმ-თან შეკავშირების უნარის გამო, არასპეციფიკურმა შეკავშირებამ შეიძლება გამოიწვიოს PCR პროდუქტის გადაჭარბებული რაოდენობრივი განსაზღვრა.
სურათი 01: SYBR მწვანე ტექნიკა
რა არის Taqman?
Taqman არის SYBR Green-ის ალტერნატიული მეთოდი რეალურ დროში PCR პროცესის მონიტორინგისთვის. ეს მეთოდი დამოკიდებულია Taq პოლიმერაზას ფერმენტის 5'-3' ეგზონუკლეაზას აქტივობაზე, რათა დაშალოს ზონდები ახალი ჯაჭვის გაფართოებისა და ფტორფორის გამოთავისუფლების დროს. ამ მეთოდში გამოიყენება ორმაგი მარკირებული ზონდები და ის ეფუძნება ზონდების ჰიდროლიზს. ზონდები არის ფლუორესცენტურად ეტიკეტირებული დნმ-ის ოლიგონუკლეოტიდები, რომლებსაც აქვთ ფლუორესცენტური მომხსენებელი მოლეკულა (ფტორფორი) 5' ბოლოზე და ჩამქრალი მოლეკულა 3' ბოლოზე.ისინი შექმნილია პრაიმერის ანელების მოპირდაპირე მხარეს ერთ ზოლიან შაბლონთან დასაკავშირებლად. Taq პოლიმერაზა ამატებს ნუკლეოტიდებს პრაიმერს და აგრძელებს ახალ ძაფს ორმაგი მარკირებული ზონდებისკენ. როგორც კი Taq პოლიმერაზა ხვდება ზონდს, Taq პოლიმერაზას ეგზონუკლეაზური მოქმედება ააქტიურებს და ანადგურებს ზონდს. მას შემდეგ რაც დაასრულებს ახალი ჯაჭვის სინთეზს, ზონდი ექვემდებარება სრულ დეგრადაციას და ათავისუფლებს ფტორფორს. ფტორფორის გამოშვება ფლუორესცენციას წარმოშობს. ფლუორესცენტური ჩაქრობის მოლეკულა ეფექტურად აქრობს გამოსხივებულ შუქს და ქმნის გამოსავალს PCR პროდუქტის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის. ფტორფორების გამოყოფა და PCR პროდუქტების რაოდენობა პროპორციულია. აქედან გამომდინარე, რაოდენობრივი დადგენა მარტივად შეიძლება გაკეთდეს ტაკმანის მეთოდით.
სურათი 02: Taqman მეთოდი
Taqman მეთოდი გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ში, გენის ექსპრესიის რაოდენობრივად განსაზღვრა, გენეტიკური პოლიმორფიზმის გამოვლენა, ქრომოსომული დნმ-ის წაშლის რაოდენობრივი განსაზღვრა, ბაქტერიების იდენტიფიკაცია, მიკროსარეის ანალიზის დამოწმება, SNP გენოტიპირება და ა.შ.
რა განსხვავებაა SYBR მწვანესა და Taqman-ს შორის?
SYBR გრინი vs Taqman |
|
| SYBR მწვანე დაფუძნებულია დნმ-ის დამაკავშირებელ საღებავზე. | Taqman დამოკიდებულია ჰიბრიდიზაციის ზონდებზე და Taq პოლიმერაზას 5'-დან 3'-მდე ეგზონუკლეაზურ აქტივობაზე. |
| ფლუორესცენტურად მარკირებული ზონდები | |
| არ არის საჭირო ფლუორესცენტურად მარკირებული ზონდები. | საჭიროა ორმაგი მარკირებული ზონდები. |
| მულტიპლექსის გენის ანალიზი | |
| ის არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას მულტიპლექსური გენის სამიზნეებისთვის. | ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას მულტიპლექსური გენის სამიზნეებისთვის. |
| ფასი | |
| ეს უფრო იაფია. | ეს უფრო ძვირია. |
| სპეციფიკურობა | |
| ეს ნაკლებად სპეციფიკურია და უკავშირდება ნებისმიერ ორჯაჭვიან დნმ-ს | ეს არის ძალიან სპეციფიკური, რადგან ზონდები აღმოაჩენენ სპეციფიკურ გამაძლიერებელ პროდუქტებს. |
| ეფექტურობა | |
| ეს ნაკლებად ეფექტურია. | ეს ძალიან ეფექტურია. |
| აპლიკაცია | |
| ეს გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ში, აგაროზის გელის ვიზუალიზაციაში, დნმ მარკირებაში და ა.შ. | ეს გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ში, გენის ექსპრესიის რაოდენობრივ განსაზღვრაში, გენეტიკური პოლიმორფიზმის გამოვლენაში და ა.შ. |
რეზიუმე – SYBR Green და Taqman
Taqman და SYBR green არის ორი მეთოდი, რომელიც გამოიყენება რეალურ დროში PCR-ში (რაოდენობრივი PCR). ორივე მეთოდი იძლევა PCR პროდუქტის რაოდენობრივ განსაზღვრას ეფექტურად და ეყრდნობა ფლუორესცენციის ემისიას. Taqman მეთოდი იყენებს ორმაგი მარკირებულ ზონდებს დაგროვილი დნმ-ის გამოსავლენად, ხოლო SYBR Green მეთოდი იყენებს ფლუორესცენტულ საღებავს. ორივე ამ მეთოდს ასევე აქვს განსხვავებული გამოყენება მოლეკულურ ბიოლოგიაში.
